Tartalom
Az elektroforézis technikák a DNS-molekulákat méretük alapján különítik el; a fehérjékhez hasonló technikák méretük vagy töltésük alapján elválaszthatják őket. Mindkét esetben a gél, amelyen keresztül a molekulák vándorolnak, pufferoldat, egy olyan vegyi anyag felhasználásával készül, amely a pH stabilizálására hat. A kupak számos fontos szerepet tölt be az elektroforézisben.
jelenlegi
Az elektroforézis gél úgy működik, hogy elektromos áramot alkalmaz a pufferben lévő víz alatti géllemezre. A DNS-molekulák negatív töltésűek, és a fehérjéket először negatív töltéssel lehet feltölteni, majd nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) kezeljük. A fehérjék vagy a DNS-molekulák a negatív töltésű katódból a pozitív töltésű anódba vándorolnak. A víz azonban viszonylag gyenge jármű az áramban - csak akkor hatékonyan szállítja az áramot, ha feloldja benne az anyagokat, mivel a feltöltött ionok elektromos térben mozognak. A pufferoldat nagyobb ionkoncentrációval rendelkezik (magasabb ionerősség), így sokkal tisztaabb, mint a tiszta víz.
PH változás
A pH a hidrogénion koncentrációját méri. A pH változása megváltoztathatja a molekulák, például fehérje vagy DNS nettó töltését, ami lassabb (vagy gyorsabb) migrációt okoz. Ez azért van, mert ezek a molekulák olyan alapvető részeket tartalmaznak, amelyek elfogadják a hidrogénionokat (protonokat) és számos savas alkotórészt, amelyek protonokat adhatnak. Amikor egy sav protonot ad, akkor negatívan töltődik; amikor egy bázis protont fogad el, éppen ellenkezőleg, pozitívan töltődik. Ahogy a hidrogénionok koncentrációja az oldatban nő, a fehérjék és a DNS kevésbé negatívan töltődik (vagy több pozitív töltésű). Az a pH, amelynél egy molekula, mint a fehérje, nem töltődik, izoelektromos pontnak nevezik. A pufferek stabilizálják a gél pH-ját olyan szinten, ahol a DNS negatív töltésű lesz, és a kívánt esetben vándorol.
Halmozási gél
A pufferek még összetettebb szerepet játszanak az SDS-PAGE nevű elektroforézisben, vagy nátrium-dodecil-szulfátban, poliakrilamid gélelektroforézisben. Ez a fehérje-analízis egyik leggyakoribb technikája. Ezeket hőkezeléssel denaturáljuk, majd nátrium-dodecil-szulfáttal bevonjuk, és csak ezután adjuk hozzá a gélhez, amely általában függőlegesen fut. A gélnek két régiója van, az egyik a halmozott (a felső részen) és az alatta futó. Az egymásra rakható gélt egy másik pufferrel állítjuk elő úgy, hogy a pH-értéke alacsonyabb, mint a futó gélé, továbbá kisebb ionerőssége van. Ez a két tényező a fehérje egymásra rakódását okozza, így egyidejűleg a futó gélben megy végbe. Ez a hatás biztosítja a fehérjék elválasztását a gélben méretüknek megfelelően.
Cap DNS elektroforézis
A DNS-gélelektroforézis két leggyakoribb puffere a trisz-acetát-EDTA és a trisz-borát-EDTA, ahol EDTA jelentése etilén-diamin-tetraecetsav. Fontos, mert a magnéziumionok kelátképzőjeként szolgál, eltávolítva azokat az oldatból. Ezek az ionok alapvető DNS-ként nevezett DNS-eknek nevezett enzimek, így a pufferben lévő EDTA extra óvintézkedésekként szolgál a DNS-ekkel kapcsolatos problémák megelőzésére.